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            Stbl4感受態

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            Stbl4:                                                              100μl/支
            pUC19 (control vector,10pg/μl):                         10μl
            保存條件(保質期):                                  -80℃(6個月) 

             
            基因型
            F′ proAB+ lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR)mcrA ∆(mcrBC-hsdRMS-mrrrecA1 endA1 gyrA96 galthi-1 supE44 λ- relA1∆(lac-proAB)

             
            產品說明
            Stbl4菌株來源于 Stbl2 E. coli strain,可用于慢病毒載體或逆轉錄病毒載體的構建。Stbl4菌株適合克隆不穩定插入片段 (正向重復序列,逆轉錄病毒序列等);mcrA突變和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使該菌株更適于克隆甲基化的基因組序列。recA 1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacIqZΔM15標記使得Stbl4菌株可用于藍、白斑篩選。此菌株具有四環素抗性。唯地生物生產的Stbl4感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達1×10cfu/μg DNA。

             
            操作方法
            1. Stbl4感受態細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA(質;蜻B接產物)并用手撥打EP管底混勻,冰中靜置25分鐘。
            2. 42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動會降低轉化效率。
            3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養基 (LB),混勻后37℃,200 rpm復蘇70分鐘。
            當質粒中含有不穩定片段時,30℃培養可降低錯誤重組的概率,若轉化control pUC19計算轉化效率,則需37℃,225 rpm復蘇60分鐘
            4. 5000 rpm離心1分鐘收集菌體,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的LB培養基上,平板倒置放于37℃培養箱過夜培養17-20小時或30℃培養箱過夜培養20-24小時。若轉化control pUC19計算轉化效率,則需37℃培養過夜。
            5.若要獲得大量,高純度質粒,建議在TB培養基中30度搖菌培養(以標準質粒PUC19為例:500ml三角瓶中加入100ml TB營養液,經30度250rpm搖菌,可提取約100-200ug PUC19質粒)

            ●TB 培養基配方
            1.2%     Tryptone
            2.4% Yeast Extract
            4%        甘油
            17mM   KH2PO4
            72mM   K2HPO4
            配制方法(1L):
            1,   配制磷酸緩沖液(0.17M  KH2PO4, 0.72M  K2HPO4):
            溶解2.31g KH2PO4和 12.54g K2HPO4于90ml去離子水中,定容到100ml,高壓滅菌。
            2,在燒杯中加入以下試劑:Tryptone 12g, Yeast Extract    24g,甘油  4ml;加入去離子水800ml,充分溶解后,定容至900ml,高壓滅菌。
            3,待溶液冷卻至60度以下,加入100ml 滅菌磷酸鹽緩沖液。
             


            注意事項

            1. 感受態細胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內加入目標DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存
             

            放會降低轉化效率。
            2. 轉化高濃度的質;蚋咝实倪B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。
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